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2023-07-21 14:07 | 蛋白组学、代谢组学、多层组学定制服务专家
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什么是衍生化？
衍生化是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质，一般是化合物的某个特定原子或者特定基团被取代成衍生化物的特定基团。一般来说，一个特定功能的化合物参与衍生反应溶解度、沸点、熔点、聚集态或化学成分会产生偏离。由此产生的新的化学性质可用于量化或分离。
为什么要衍生化？
没有衍生化的样品成分复杂，熔点、沸点、物质极性状态都不尽相同，不符合气相色谱进样条件，同时也会对柱子损伤极大。
倘若上机样品没有进行衍生化实验，直接将含有复杂成分的样品注射到色谱系统中，可能会出现以下几种情况：
▶样品没有完全在进样口端气化，有部分样品残留在进样口衬管中。导致进样不准确，定性和定量结果不可靠、不准确。
▶少部分液体可能会通过衬管和分流平板进入到色谱柱中导致色谱柱出现问题，发生堵塞现象，在进样口端切掉0.5-1m左右长度的色谱柱进行维护。长期使用的色谱柱也可以按照这种方法进行维护。
▶走出来的峰保留时间不准、出峰早、峰形差、结果不可靠等其他情况。
现有的常用衍生化技术（GC-MS）
1.硅烷化
硅烷基指三甲基硅烷Si(CH3)3或称TMS。硅烷化作用是将硅烷基引入到分子中，一般是取代活性氢。活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性。化合物中减少了氢键的束缚，所形成的衍生化物更容易挥发。而且含活性氢的反应位点数目减少，其稳定性得以加强。硅烷化化合物极性减弱，色谱行为改善。
常用试剂：双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺BSTFA、N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA。
2.酰基化
酰基化作为硅烷化的替代方法，可通过羧酸或共衍生物的作用将含有活泼氢化合物（如-OH、-SH、-NH）转化为酯、硫酯或酰胺。含有卤离子的羰基基团可增强电子捕获器，酰化作用的优点：保护不稳定基团，增加化合物的稳定性；提高糖类，氨基酸的物质的挥发性；有助于混合物的分离。常用的试剂有乙酸酐、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、N-甲基双（三氟乙酸酐）咪唑、1-（三氟乙酰）咪唑。
3.烷基化
烷基化作用是将烷基官能团（脂肪族或脂肪，芳香族）添加到活性官能团（H）上。以烷基基团替代氢的重要性在于生成的衍生物与原来化合物相比极性大为下降。该试剂常用于修饰改良含有酸性氢的化合物如羧酸和苯酚。
衍生化细说篇
本篇将会给大家介绍衍生化实验的流程，气相色谱质谱联用技术的仪器原理和上机以及简单的使用维护。
衍生化实验基本操作流程
环境湿度控制在32%以下：
（点击图片查看大图）
GC-MS常用衍生化实验——硅烷化实验
对挥干后的样本内的化合物，引入三甲基硅烷基团 -Si(CH3)3，取代活泼氢（-H）。对一些极性较大的化合物，通过引进这个基团能大幅度降低化合物的极性。同时因为活泼氢被取代导致化合物内的活泼位点减少，使得衍生化物的热稳定性增强。化合物内的活泼氢位点减少还带来一个现象，就是氢键作用力减弱，衍生化物的挥发性增强。衍生化所用的试剂基本都是非极性的试剂。所以一些极性化合物经过衍生化，它的极性变小，被溶解在非极性的试剂中，而那些不能被衍生化，同时也无法被溶解，就会在底部形成沉淀。如果形成了沉淀就需要常温离心，将上清的部分取出。这样是为了防止在进样的时候将进样针堵住，出现报错现象。
肟化反应原理：肟化反应是指含有羰基的化合物（如醛、酮类）与羟胺作用而生成含有C=NOH基的化合物的反应。此过程可以保护酮基和醛基，特别是对于糖类物质可以有效避免一些复杂反应的产生，因此对于含酮基和醛基的物质会先与甲氧胺盐盐酸反应生成基团“-C(R)=N-O-”。相关反应式如下：
R1-C=O-R2+CH3-O-NH2·HCl→R1-C(R2)=N-O-CH3
硅烷化反应原理：此反应主要是物质中的活性氢（如含羟基-OH、羧基-COOH、氨基-NH2、巯基-SH及磷酸基团-H2PO4等物质）被硅烷基取代的过程，本研究所用的衍生化试剂为BSTFA(含1%TMCS)，因此衍生化过程中的活性氢被三甲基硅烷（trimethylsilyl ,TMS）取代。常见活性氢硅烷化反应如下：
R-C(=O)-OH→R-C(=O)-O-Si(CH3)3
R-OH→R-O-Si(CH3)3
R-SH→R-S-Si(CH3)3
R-NH2→R-N-[Si(CH3)3]2
R1-NH-R2→R1-N[Si(CH3)3]-R2
衍生化技术的优势和局限
衍生化技术的优势（对羟基、胺基、羧基等官能团衍生化起到十分重要的作用）
1．改善样品的气相色谱性质。如羟基、羧基的气相色谱特性不好；
2．改善样品的热稳定性；
3．改善样品的分子量。分子量大，有利于样品与基质分离；
4．改善样品的质谱行为；
5．引入卤素或吸电子基团，使样品可用CI检测，提高灵敏度；
6．分离手性化合物；
衍生化技术的局限性
1． 柱上衍生化的方式可能损伤色谱柱；
2． 某些衍生化试剂需要使用氮气挥干；
3． 衍生化不完全，影响灵敏度；
4． 衍生化试剂不当，产物分子量过大，导致分子离子峰碎片质量m/z超出扫描质量范围；
衍生化应用篇
•血清代谢物衍生后检测
图1 | 人血清的色谱图图像
•细胞代谢物衍生后检测
图2 | 人细胞的色谱图图像
•植物组织代谢物衍生后检测
图3 | 植物叶片的色谱图
•动物组织代谢物衍生后检测
图4 | 小鼠组织的色谱图
•微生物代谢物衍生后检测
图5 | 小球藻的色谱图
•土壤环境代谢物衍生后检测
图5 | 土壤环境代谢物色谱图
•植物蜡质类分子衍生后检测
图6 | 果实蜡质类分子色谱图
文末看点
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