在生物医学研究的广阔领域中,细胞活性检测扮演着至关重要的角色。它不仅帮助科学家们评估细胞的生存状态,还能深入了解细胞对药物、环境变化或病理过程的响应。细胞活性检测通常包括测量细胞增殖、细胞毒性和细胞死亡等方面。今天,小爱向大家介绍细胞活性检测的六大常用方法:ATP生物发光法、LDH检测法、MTT比色法、CCK-8法、荧光染料法和细胞凋亡检测法,一起揭秘细胞活力的科学奥秘。
1、ATP生物发光法
细胞内ATP(腺苷三磷酸)的含量是细胞能量代谢的直接指标。ATP生物发光法通过测量细胞内ATP的水平来评估细胞活性。这种方法具有高灵敏度和宽动态范围,尤其适合于需要高灵敏度检测的实验。
图1 ATP检测试剂盒(abs580117)检测细胞活性的原理图
ATP生物发光法的主要原理是在有氧环境下,荧光素在荧光素酶和Mg2+的催化作用下与ATP发生反应,生成荧光素-AMP复合体并释放出焦磷酸(PPi)。随后,荧光素-AMP复合体在O2的作用下进一步生成氧化荧光素,同时释放出CO2和H2O。在这个过程中,激发态的氧化荧光素返回到基态时会发出光子,光子的数量与ATP含量成正比,因此可以通过测量光强度来定量ATP的含量。
2、LDH检测法
乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)是一种广泛存在于细胞中的酶,它在糖酵解途径中起着关键作用,能够催化乳酸和丙酮酸之间的可逆反应。LDH催化乳酸产生丙酮酸,丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,后者在碱性溶液中呈棕红色,颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比,通过测定OD值,可计算LDH的活力。在细胞活性检测中,LDH的释放通常被用作细胞膜完整性的指标。当细胞膜受损时,细胞内的LDH会释放到培养基中,通过测定培养基中LDH的活性,可以评估细胞的损伤或死亡程度。
3、MTT比色法
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物)比色法是一种经典的细胞活性检测方法。它通过测量活细胞中脱氢酶的活性,将MTT还原成紫色的甲瓒产物,从而间接反映细胞的代谢活性。这种方法操作简单,成本低廉,是实验室中常用的筛选工具。
4、CCK-8法
CCK-8(Cell Counting Kit-8)法是一种基于WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐)的比色方法。它通过测量细胞线粒体脱氢酶的活性来评估细胞活性。CCK-8法具有较高的灵敏度和较宽的动态范围,适合于各种细胞类型的活性检测。
5、荧光染料法
荧光染料法利用特定的荧光染料,如Calcein-AM或CFSE,来标记活细胞。这些染料在活细胞内被代谢成荧光产物,通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。荧光染料法可以提供直观的细胞活力图像,适用于细胞增殖和迁移研究。
6、细胞凋亡检测
细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程,与细胞活性密切相关。通过Annexin V和PI(碘化丙啶)染色,可以检测细胞表面的磷脂酰丝氨酸外化,从而评估细胞凋亡的程度。这种方法对于研究细胞死亡机制和药物毒性具有重要意义。
细胞活性检测六大常用方法优缺点比较
每种方法都有其特定的应用场景和限制,选择合适的检测方法需要根据实验的具体需求和条件来决定。
下面小爱着重为大家介绍具有高灵敏度、操作简便、快速等优点的ATP检测法。
ATP检测试剂盒(abs580117)使用方法
一、产品组成
二、使用方法
1、需自备的试剂和器材
1)细胞培养用pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)
2)Triton X-100
3)系列可调节量程移液器及吸头
4)离心管及白色96孔板
5)化学发光酶标仪
2、实验前准备
1)样品准备:
①细胞培养上清的准备:将需要测定的细胞接种到培养板中,经过干预因素处理后,直接吸取细胞上清,如果是悬浮细胞,4℃、300g离心5min,收集上清。
②细胞裂解上清的准备:将需要测定的细胞(1×106-1×107)收集到5mL的离心管中,4℃、300g离心5min,弃去上清,然后加入200μL含0.1%Triton X-100的PBS,冰浴裂解30min,4℃、10000g离心10min,收集上清。
③组织裂解上清的准备:将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中,然后加入500μL含1%Triton X-100的PBS,匀浆1min,4℃、10000g离心10min,收集上清。
注:各种样品,如果不立即进行测定,请冻存于-80℃;正式测定前根据预实验结果,利用ATP Assay Buffer将样品适当稀释后进行测定。
2)标准品的准备:
在1.5mL离心管中,加入990μL ATP Assay Buffer,再取10μL的100μM浓度ATP Standard加入离心管中配制1μM浓度ATP Standard;然后取另外8根1.5mL离心管,分别加入200μL ATP Assay Buffer,再吸取200μL的1μM浓度ATP Standard依次倍比稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0.0078、0.0039μM浓度。
3)检测工作液的准备:
ATP检测工作液的配制:根据待测样品数参考下表配制适当量的ATP检测工作液,表中试剂按比例混合后即为ATP检测工作液。
3、操作步骤
1)在白色96孔板中设置空白对照孔、标准品孔和样品孔,参考下表,在空白对照孔中加入50μL ATP Assay Buffer,在标准品孔中加入50μL梯度浓度ATP 检测工作液(0.0039-1μM),在样品孔中加入50 μL样品。
2)如上表所示,各孔加入50μL的ATP检测工作液,混匀,室温孵育5min。
3)待反应完成后,利用化学发光酶标仪测定相对发光强度(RLU)。
4)计算结果:利用标准品浓度为横坐标,RLU值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间的函数关系式,然后利用各样品的RLU值计算样品中ATP浓度。ATP标曲测定如下图所示:
细胞活性检测是连接基础研究与临床应用的桥梁。通过上述六种常用方法,研究人员可以更准确地评估细胞的生存状态,为疾病治疗和药物开发提供重要信息。随着生物技术的不断进步,未来可能会有更多创新的检测方法问世,为我们揭示细胞活力的更多奥秘。
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