实验记录｜蛋白的提取
蛋白提取原理：蛋白质是一切生命活动的承担者，为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究，进一步阐明众多疾病的机制，同时为疾病治疗提供理论依据，因此需要提取目的蛋白，由于蛋白质种类繁多，结构复杂，需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。
一、贴壁细胞蛋白的提取：（所有操作均在冰上进行）
准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用
1.裂解液制备：每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解），配好后冰上备用；
2.此处以6孔板为例，吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液，清洗 2-3次，吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；
3.加入适当体积的裂解液，让裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min；
4.裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞及裂解液吸入离心管，放离心机4℃ 12000rpm 离心30min（离心机提前预冷），上清即为蛋白溶液，细胞碎片沉降于底部；
5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA定量分析；c.做western blot，需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同，例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。
二、组织中总蛋白的提取：
1.将已称重的冷冻组织（约50mg）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，（有的需要加入液氮），直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；
2.裂解液制备：取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)；
3.取适量研磨的匀浆放入离心管，加入配好的裂解液，冰上孵育40min；
4.离心：4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清；
5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。
蛋白样品制备的原则：
1.蛋白提取过程需要冰上操作，尽可能减少蛋白降解；
2.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失；
3.低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解；