运用原位dna末端标记技术观察毛母质瘤中的细胞凋亡

中华皮肤科杂志1998年第6期第31卷论著摘要

作者：倪晓孙建方姜群曾学思杨海平桑红桂李阿梅高新元叶干运

单位：210042南京，中国医学科学院中国协和医科大学皮肤病研究所

毛母质瘤又称钙化上皮瘤，是一种良性的表皮附属器肿瘤，主要由比例不等的嗜碱性细胞和影细胞组成，常常还可以见到另一型肿瘤细胞-过渡细胞(transitionalcell)，这种细胞具有固缩的核，形态学和超微结构特点类似凋亡细胞。末端脱氧核苷酰转移酶(tdt)介导的dutp-生物素缺口末端标记(tunel)技术是一种在常规福尔马林液固定、石蜡包埋组织切片上检测凋亡细胞的敏感方法，这一技术用tdt将生物素化的dutp(biotin-11-dutp)标记到dna片段的3'-oh末端，该生物素可以通过与亲和素的特异性结合，使亲和素-辣根过氧化物酶(avidin-hrp)结合在dna断裂缺口部位，加入hrp显色底物后在原位出现有色沉淀，从而可以在光镜下观察到被着色的凋亡细胞，我们运用这一技术研究了12份毛母质瘤标本中的细胞凋亡现象。

一、材料和方法

12份标本均来自本所病理室，均经组织学检查诊断为毛母质瘤，镜下均可见到3种细胞成分：嗜碱性细胞、过渡细胞和影细胞。在经典tunel方法上稍加改进，主要实验步骤如下：切片常规脱蜡水化，20μg/ml蛋白酶k消化15分，0.3％过氧化氢室温处理20分，标记缓冲液室温1分，冰上加标记液(含0.3u/μltdt和0.04nmol/μl生物素-11-dutp)，放置湿盒中37℃孵育60分，封闭液室温10分，1∶50稀释的亲和素-hrp37℃孵育30分，pbs充分浸洗后加新鲜配制的0.03％过氧化氢-0.5mg/mldab显色液，显色10分，镜下观察，充分显色后，苏木素复染，封片镜检[1,2]。

二、结果

he染色切片示：肿瘤位于真皮上部，并延伸到真皮深部，由形态不规则的细胞岛组成。形态学上，肿瘤呈现出4个分区：嗜碱性细胞区、影细胞区、过渡细胞区和无定形碎片区。嗜碱性细胞区分布于肿瘤的一边或周边，影细胞区与嗜碱性细胞区相连或间有数层过渡细胞，影细胞的核消失，但仍可见核部位未着色的影子，细胞间连接清晰可见，过渡细胞或与嗜碱性细胞相连，或环绕在影细胞周边，细胞皱缩，细胞核浓缩、贴边呈环状或新月状，胞浆透明(图1)。无定形碎片区与影细胞区相连，其中可见散在出血和少量混合炎症细胞浸润。

图1毛母质瘤中过渡细胞，与嗜碱性细胞相连，细胞皱缩、

核浓缩贴边呈环状或新月状，胞浆透明（he×200）

tunel染色切片示：过渡细胞呈tunel阳性反应，核染色深，呈环状或新月状，细胞浆淡染，阳性细胞呈群或呈带状分布，在过渡细胞区中，未见凋亡小体。在无定形碎片区，未见阳性细胞结构，只见大小不等的tunel阳性凋亡小体弥漫分布，凋亡小体集中在影细胞与无定形碎片区的交界处，小的凋亡小体则单个或成群散在碎片间或碎片周围。在嗜碱性细胞区和影细胞区中未见阳性结构。

三、讨论

我们的初步实验结果提示，过渡细胞是一种即将死亡的凋亡细胞，依据有：1he染色切片中，过渡细胞的核变化符合kerr等[3]描绘的凋亡细胞核的形态学特征；2tunel染色切片中，过渡细胞呈tunel阳性反应，提示过渡细胞中有dna的片段化。

有人对毛母质瘤中嗜碱性细胞、过渡细胞、影细胞和无定形碎片区间的关系提出新的看法，他们认为嗜碱性细胞可能具有两个不同的归宿：其一是，嗜碱性细胞直接分化成影细胞，这是一条已被公认的分化途径，我们也观察到，在毛母质瘤的某些区域，嗜碱性细胞直接过渡为影细胞，这与kishimoto等[4]的观察一致，他们的电镜还证实，影细胞的超微结构特点也不同于凋亡细胞；其二是，嗜碱性细胞经由过渡细胞变成无定形碎片，这是一条程序化细胞死亡的途径，可能是机体排除肿瘤细胞的一种功能活动。电镜观察证明，在嗜碱性细胞区与影细胞区的过渡区中，可见到具有凋亡细胞超微结构(染色质浓缩、贴边，细胞膜和细胞器完整，核膜出泡)的明细胞和不具有凋亡细胞超微结构特点的暗细胞。我们认为这一看法有一定的道理，但仍需更多的证据。我们的实验结果提示，过渡细胞是一种即将死亡的凋亡细胞，不具有分化潜能，不可能分化成影细胞。

参考文献

1gavrieliy,shermany,ben-sassansa,etal.identificationofprogrammedcelldeathinsituviaspecificlabelingofnucleardnafragmentation.jcellbiol,1992,119∶493-501.

2tamaday,takamah,kitamurat,etal.identificationofprogrammedcelldeathinnormalhumanskintissuebyusingspecificlabelingoffragmenteddna.brjdermatol,1994,131∶521-524.

3kerrjfr,wyllieah,currierm.apoptosis:abacicbiologicalphenomenonwithwide-rangingimplicationsintissuekinetics.brjcancer,1972,26∶239-257.

4kishimotos,nagatam,takemakah,etal.detectionofapoptosisbyinsitulablinginpilomatricoma.amjdermatopathol,1996,18∶339-343.