在多肽固相合成的流程中，为了确保氨基酸的偶联完整性和Fmoc保护基团的脱除效果，我们常常需要借助显色试剂来对肽树脂进行快速检测。茚三酮显色试剂因其反应迅速、显色清晰以及高灵敏度等特点，而备受推崇，成为最常用的试剂之一。此外，溴酚蓝和四氯苯醌等也是不错的选择。接下来，我们将详细介绍这些显色试剂的配制方法、使用步骤以及使用过程中需注意的事项。

1. 茚三酮显色试剂

茚三酮显色试剂，亦被称为Kaiser检测法，由Kaiser等人精心研发。它能敏锐地揭示游离胺的存在，为多肽固相合成中的关键检测步骤。该试剂常在氨基酸偶联前后使用，以其高灵敏度和清晰显色，成为当前应用最为广泛的检测手段。
1.1 配制方法

试剂A：将80克苯酚溶解在20毫升乙醇中，为简化配制过程，可以在配制前将苯酚加热至融化。

试剂B：向98毫升重蒸后的吡啶中加入2毫升0.001M的KCN水溶液。请注意，KCN是剧毒化学品，如果难以获取，可以省略其添加。在重蒸吡啶时，可以加入少量茚三酮以去除吡啶中可能干扰茚三酮显色的杂质。

试剂C：将5克茚三酮溶解在95毫升乙醇中。
1.2 检测方法
将少量树脂置于杜氏玻璃小管中，其量以铺满试管底部一层为宜。随后，分别向试管中加入配制好的A、B、C三种试剂各两滴，并在100-120℃的温度下加热3-5分钟。

观察树脂的颜色变化：若树脂呈现蓝色，则表明存在未保护的氨基，即脱Fmoc反应已完成。若树脂保持无色，则说明偶联反应已彻底进行。
1.3 使用说明
尽管Kaiser测试作为一种广泛应用的检测方法，但其仍存在一定的局限性。该方法无法检测二级胺，例如脯氨酸，同时也无法检测无α-H的氨基酸的氨基，如二氨基异丁酸、α-甲基亮氨酸等α-双取代氨基酸。这些局限性的存在，在一定程度上影响了Kaiser测试的适用范围。

茚三酮在与氨基进行反应时，会首先脱水缩合生成亚胺。这一步反应仅限于氨或伯胺参与。接着，亚胺经过脱羧异构化，转变为另一种亚胺形式，随后水解，释放出一分子伯胺和一分子醛。伯胺再与茚三酮缩合，生成二聚的亚胺衍生物，进而产生显色效果。而对于二级胺的检测，我们可以利用后续将介绍的四氯苯醌来进行显色。

2. 四氯苯醌显色试剂的应用

四氯苯醌显色试剂在化学检测中同样扮演着重要角色，它常被用于检测二级胺，例如脯氨酸。此外，由于脱Fmoc试剂多数为二级胺（如哌啶、吗啉、二甲胺），因此四氯苯醌显色试剂也可用于检测肽树脂，以判断在使用二级胺脱Fmoc后，残留的二级胺是否已通过洗涤彻底去除。
2.1   制备方法
试剂A的制备：
将2克四氯苯醌溶解在98毫升DMF中。

试剂B的制备：
将2毫升乙醛融入98毫升DMF中。
2.2   检测流程
将适量树脂置于杜氏玻璃小管内，其量以覆盖试管底部一层为佳。随后，分别向其中滴入两滴已配制好的A、B两种试剂。在室温环境下静置5至10分钟，若树脂呈现蓝绿色，则表明存在未受保护的氨基。

3. 溴酚蓝显色试剂

该试剂显色迅速且灵敏，但需注意，其显色反应过于敏感，有时会在偶联反应结束前就显示出假阳性结果。
3.1   制备流程

3.1   配制步骤    3.1   制备详解    3.1   如何精准配制    3.1   配制过程中的关键环节

1g溴酚蓝溶解在99ml DMA中，制备成染色溶液。

3.2   检测操作

将少量树脂置于杜氏玻璃小管中，通常以铺满试管底部一层为适量。随后，向树脂中滴加先前配制好的溴酚蓝溶液，进行即时显色反应。若树脂呈现蓝色，则表明存在未受保护的氨基。

4. TNBS显色试剂

将少量树脂置于杜氏玻璃小管中，加入适量先前配制好的TNBS显色试剂，进行显色反应。若树脂呈现黄色，则表明存在游离的氨基。
4.1   试剂配制
试剂A的配制：将5毫升DIPEA溶解于95毫升DMF中。

试剂B的配制：将1克TNBS溶于99毫升水中。

接下来，您可以根据具体需求，将适量的试剂A和试剂B混合，制备成TNBS显色试剂。
4.2   检测流程
将少量树脂置于杜氏玻璃小管中，通常以铺满试管底部一层为适量。随后，向试管中分别加入两滴已配制好的试剂A和试剂B，轻轻摇匀后在室温下静置10分钟。若树脂在静置后呈现黄色或红色，则表明存在未受保护的氨基。

5. 小结

上述检测试剂为多肽固相合成提供了迅速的检测手段，尤其适用于此类多步骤连续反应的监测。然而，这种快速检测方法也存在明显不足，它仅能进行定性分析，无法对反应进程进行定量评估。在脱Fmoc过程中，当80%的Fmoc被移除与99%的Fmoc被移除时，Kaiser测试都会呈现阳性反应，这可能导致在困难序列中仅脱除80% Fmoc时误判为完全脱除。此外，该检测方法的标准难以统一，检测时树脂取量的一致性难以保证，而检测结果的观察高度依赖主观判断，不同观察者可能对同一份检测结果产生不同的解读，特别是在困难偶联后的检测中，常会出现如树脂浅蓝色、微浅蓝色透明、无色但溶液浅蓝色以及浅紫色等模糊不清的结果。针对此类情况，建议对肽树脂进行切割，并采用HPLC进行进一步分析。