环二鸟苷酸( c-di-GMP)检测

环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate, c-di-GMP)作为细菌中广泛存在的第二信使,能够作用于不同的受体调控细菌的多种生理功能,包括生物膜的形成、细菌运动、细菌毒力、细胞周期与分化等。负责合成和降解c-di-GMP 的酶分别为二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclases, DGCs)和磷酸二酯酶(phosphodiesterases, PDEs),二鸟苷酸环化酶含有 GGDEF 保守结构域,磷酸二酯酶含有 EAL 保守结构域或 HD-GYP 结构域。胞内 c-di-GMP 的水平依赖于二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶的活性,含有 GGDEF 和 EAL/ HD-GYP 结构域的蛋白在 N 端经常会连接信号感应调控结构域,如 PAS 结构域和 REC 结构域。这些调控结构域能够感知胞内外信号,从而调控胞内 c-di-GMP 的水平;此外,c-di-GMP 合成和降解酶之间的蛋白互作及与其他蛋白之间的互作也能够调节胞内 c-di-GMP 的水平。

环二鸟苷酸（c-di-GMP）的检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。

00001. 高效液相色谱法（HPLC）：这种方法是通过测定c-di-GMP的生成量来间接测定其含量。具体的步骤包括设置一个酶活测定反应体系，其中包含DGC酶液、GTP、MgCl2和pH为8.0的Tris-HCl缓冲液。在35℃下反应一段时间后，立即在沸水浴中加热以终止反应。然后将反应液稀释至适合浓度，通过HPLC检测c-di-GMP的生成量。HPLC的具体色谱条件可能包括特定的色谱柱（如C18柱）、流动相（如磷酸盐缓冲液和乙腈的混合物）、流速、检测波长和柱温等。

00002. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：这是一种更为直接和特异性的检测方法。通过利用特异性抗体与c-di-GMP的结合，结合酶标记的二抗和底物显色，可以定量检测样品中c-di-GMP的浓度。