庆大霉素的主要作用是一种抗生素，用来抗感染治疗，主要适用于敏感的革兰氏阴性杆菌，比如大肠埃希菌、克雷伯杆菌、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门菌属、铜绿假单胞菌属，以及葡萄球菌、甲氧西林敏感菌，所引起的严重感染，比如败血症、下呼吸道感染、肠道感染、盆腔感染、腹腔感染以及皮肤、软组织感染、尿路感染等。

在治疗腹腔感染以及盆腔感染时，一般建议与厌氧菌感染的药物进行联合使用。临床上大多数采用庆大霉素和其他的抗感染药物进行联合使用，同时也可以用于中枢神经系统的感染。